细胞介绍

该细胞由U251MG/TMZ细胞通过慢病毒转染的方式携带Luc基因。

细胞特性

细胞运输、保存及注意事项

细胞培养试剂的配制

1）TMZ药物的配制及保存

建议将TMZ药物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ药物，使其完全溶解。（若所购买的TMZ药物规格为10mg，则加入625uL DMSO溶液，待其完全溶解即为16mg/mL母液）

注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

2）冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO，现用现配。

3）完全培养基的配制

细胞培养条件

气相：空气，95%；二氧化碳，5%； 温度：37℃，培养箱湿度为70%~80%。

细胞处理

1）冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3~5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。

注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度；

②建议复苏细胞时始终穿戴防护手套和面罩，避免冻存管因温差较大而发生爆炸，造成人员伤害。

2）细胞传代（建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代）

①待细胞密度达到80%~90%时，即可进行传代培养。

②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。

③加入适当体积的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶-1mL，其它培养器皿可覆盖培养底面即可），置于37℃培养箱中消化2~5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶使细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。 

④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。

⑤向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6~8mL完全培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况，2~3day换液。

注意：细胞传代过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度。

3）细胞冻存

①细胞冻存时，步骤同2）细胞传代的①~④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×10^6 ~ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

细胞筛选

稳定转染luc的细胞，随细胞传代次数的增加，其luc荧光强度逐渐减弱。若要维持荧光强度，需加入嘌呤霉素进行筛选。

初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度为1ug/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2ug/mL嘌呤霉素的完全培养基继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5ug/mL。若筛选过程中，漂浮细胞大于60%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/mL嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完全培养基正常培养。